DamID

DamID er et molekylærbiologisk protokol, der bruges til at kortlægge bindingsstederne af DNA- og kromatin-bindende proteiner i eukaryoter. DamID identificerer bindingssteder ved at udtrykke den foreslåede DNA-bindende protein som et fusionsprotein med DNA methyltransferase. Binding af proteinet af interesse til DNA methyltransferase lokaliserer i regionen bindingsstedet. Adenosin methylering ikke forekommer naturligt i eukaryoter og dermed adenin-methylering i en region kan det konkluderes at være blevet forårsaget af fusionsproteinet, hvilket indebærer regionen er beliggende nær et bindingssted. DamID er en alternativ metode til at chip-on-chip.

Beskrivelse af fremgangsmåden

Princip

N6-methyladenin er produktet af tilsætning af en methylgruppe i stilling 6 i adenin. Denne modificerede nukleotid er fraværende fra det store flertal af eukaryoter, men er udbredt i bakterielle genomer, som en del af begrænsningen ændring eller DNA reparationssystemer. I Escherichia coli, er adenin methylering katalyseret af adenin methyltransferase Dam, som katalyserer adenin methylering udelukkende palindromsekvensen GATC. Ektopisk ekspression af Dam i eukaryote celler fører til methylering af adenin i GATC-sekvenser uden nogen anden mærkbar bivirkning.

Baseret på dette, DamID består i at fusionere Dam til et protein af interesse eller en kromatin komponent. Proteinet af interesse således målretter Dam til dets beslægtede in vivo bindingssted, hvilket resulterer i methylering af tilstødende GATCs. Tilstedeværelsen af ​​m6A, hvilket faldt sammen med bindingsstederne af proteinerne af interesse, er afsløret med methyl PCR.

Methyl-PCR

I dette assay genomet fordøjes af Dpnl, som skærer kun methylerede GATCs. Dobbeltstrengede adaptere med en kendt sekvens er derefter ligeret til enderne genereret af Dpnl. En PCR med primere matchende adapterne udføres derefter, hvilket fører til specifik amplifikation af genomiske fragmenter flankeret af methylerede GATCs. I praksis er ligeringsprodukter fordøjet af DpnII forudgående PCR-amplifikation. Dette enzym skærer ikke-methylerede GATCs, således at kun fragmenter flankeret af konsekutive methylerede GATCs amplificeres.

Særlige forhold DamID versus ChIP

Chip er en alternativ metode til analyse proteinbinding på specifikke loci i genomet. I modsætning chip, betyder DamID ikke kræve et specifikt antistof mod proteinet af interesse. På den ene side gør det muligt at kortlægge proteiner, for hvilke en sådan antistoffet er til rådighed. På den anden side, hvilket gør det umuligt at specifikt kort posttranslationelt modificerede proteiner.

En anden grundlæggende forskel er, at chip-analyser, hvor proteinet af interesse er på et givet tidspunkt, mens DamID analyser, hvor det har været. Årsagen er, at m6A forbliver i DNA efter Dam fusionsproteinet forsvinder. For proteiner, der enten bundet eller ubundet på deres målsteder dette ændrer ikke det store billede. Dette kan dog føre til store forskelle i tilfælde af proteiner, der glider langs DNA.

Kendte fordomme og tekniske spørgsmål

Plasmid methylering skævhed

Afhængigt af hvordan eksperimentet udføres, kan DamID være underlagt plasmid methylering bias. Fordi plasmider er normalt amplificeret i E. coli, hvor Dam udtrykkes naturligt, er de methylerede på hver GATC. I eksperimenter med transient transfektion DNA'et af disse plasmider udvundet sammen med DNA af transficerede celler, hvilket betyder, at fragmenter af plasmidet forstærkes i mePCR. Hver sekvens af genomet, der deler homologi eller identitet med plasmidet kan således synes at være bundet af proteinet af interesse. Især gælder dette for den åbne læseramme af proteinet af interesse, der er til stede i både plasmidet og genomet. I microarray eksperimenter, kan denne skævhed anvendes til at sikre, at den korrekte materiale blev hybridiseret.

Apoptose

Apoptotiske celler nedbrydes deres DNA i en karakteristisk nukleosom stigemønster. Dette genererer DNA-fragmenter, som kan ligeres og amplificeret under DamID procedure. Indflydelsen af ​​disse nukleosomale fragmenter på bindingen profil af et protein er ikke kendt.

Løsning

Løsningen af ​​DamID er en funktion af tilgængeligheden af ​​GATC sekvenser i genomet. Et protein kan kun kortlægges inden for to på hinanden følgende GATC sites. Den mediane afstand mellem GATC fragmenter er 205 bp i Drosophila, 260 i mus og 264 hos mennesker.

  0   0
Forrige artikel Dương

Relaterede Artikler

Kommentarer - 0

Ingen kommentar

Tilføj en kommentar

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Tegn tilbage: 3000
captcha