Cofaktor Engineering

Cofaktor teknik, en delmængde af metabolic engineering, defineres som manipulation af anvendelsen af ​​cofaktorer i en organismes metaboliske veje. I cofaktor engineering, måles koncentrationen af ​​cofaktorer ændret med henblik på at maksimere eller minimere metaboliske flux. Denne type teknik kan anvendes til at optimere produktionen af ​​en metabolit produkt eller for at øge effektiviteten af ​​en metabolisk netværk. Brugen af ​​tekniske encellede organismer til at skabe lukrative kemikalier fra billige råvarer er stigende, og cofaktor teknik kan spille en afgørende rolle i at maksimere produktionen. Feltet har vundet mere popularitet i det seneste årti, og har flere praktiske anvendelser i kemisk produktion, bioteknologi og farmaceutiske industri.

Cofaktorer er ikke-protein forbindelser, der binder til proteiner og er nødvendige for proteinerne normal katalytisk funktion. Cofaktorer kan betragtes som "hjælpeceller molekyler" i biologisk aktivitet og berører ofte funktionaliteten af ​​enzymer. Cofaktorer kan være både organiske og uorganiske forbindelser. Nogle eksempler på uorganiske cofaktorer er jern eller magnesium, og nogle eksempler på organiske cofaktorer indbefatter ATP eller coenzym A. Organiske cofaktorer er mere specifikt kendt som coenzymer, og mange enzymer kræver tilsætning af coenzymer at antage normale katalytiske funktion i en metabolisk reaktion. De coenzymer binder til det aktive sted af et enzym for at fremme katalyse. Ud fra et teknisk cofaktorer og coenzymer, kan et naturligt forekommende metaboliske reaktion manipuleres til at optimere produktionen af ​​en metabolisk netværk.

Baggrund

Cofaktorer blev opdaget af Arthur Harden og William Young i 1906, da de fandt, at antallet af alkoholiske gæring i ukogte gærekstrakter øges, når kogt gærekstrakt blev tilføjet. Et par år efter, Hans von Euler-Chelpin identificerede cofaktor i kogt ekstrakt som NAD. Andre cofaktorer, såsom ATP og coenzym A, blev opdaget senere i 1900-tallet. Mekanismen af ​​cofaktor aktivitet blev opdaget, da Otto Heinrich Warburg bestemt i 1936, at NAD fungerede som en elektronacceptor. Godt efter disse indledende opdagelser, forskerne begyndte at indse, at manipulation af cofaktor koncentrationer kunne bruges som redskaber til forbedring af metaboliske veje.

En vigtig gruppe af organiske cofaktorer er familien af ​​molekyler, der er nævnt som vitaminer. Vitamin B12, for eksempel, spiller en afgørende rolle i den menneskelige krop, mens coenzym B12, dets derivat, der findes i stofskiftet af enhver type celle i vores kroppe. Dens tilstedeværelse påvirker syntese og regulering af cellulære DNA samt at tage del i fedtsyre syntese og energiproduktion. Cofaktorer er nødvendige af mange vigtige metaboliske veje, og det er muligt for koncentrationerne af en enkelt type cofaktor at påvirke strømme af mange forskellige veje.

Mineraler og metalioner, som organismer optagelse gennem deres kost giver gode eksempler på uorganiske cofaktorer. For eksempel Zn er nødvendig for, at enzymet kulsyreanhydrase som det omdanner kuldioxid og vand til bicarbonat og protoner. Et bredt anerkendt mineral, der fungerer som en cofaktor er jern, som er afgørende for den korrekte funktion af hæmoglobin, ilt transport protein, der findes i de røde blodlegemer. Dette eksempel især fremhæver betydningen af ​​cofaktorer i dyremetabolisme.

Betydning

Cofaktor engineering er væsentlig i manipulation af metaboliske veje. En metabolisk vej er en række kemiske reaktioner, der foregår i en organisme. Metabolic engineering er genstand for ændring af strømme i en metabolisk vej. I metabolic engineering, kan en metabolisk vej direkte ændres ved at ændre funktionaliteten af ​​enzymer involveret i reaktionsvejen. Cofaktor teknik, tilbyder en særskilt strategi, og nogle fordele, at ændre en metabolisk vej. I stedet for at ændre de enzymer, der anvendes i en vej, kan de cofaktorer ændres. Dette kan give metaboliske ingeniører en fordel på grund af visse egenskaber af cofaktorer og hvordan de kan ændres.

Metaboliske veje kan anvendes af metaboliske ingeniører til at skabe et ønsket produkt. Ved at ændre de typer af cofaktorer anvendes, og de tidspunkter, hvor de anvendes, kan resultatet af den metaboliske ændring af netværk. For at oprette en større produktion af et produkt, metaboliske ingeniører har evnen til at levere netværket med alt efter hvilken cofaktor er bedst egnet til den specifikke proces. Dette fører til optimering af netværk til opnåelse af en højere produktion af ønskede produkter. Også ændre cofaktorer anvendes i et netværk kan være en opfindsom løsning på et kompliceret problem. Et netværk, der er til stede i cellen, men det er ofte ubrugt, kan have et ønskeligt produkt. I stedet for at manipulere en helt nyt sæt veje til at producere produktet, kan anvendes cofaktor engineering. Ved at erstatte enzymer at anvende cofaktorer let tilgængelige i en celle, typisk ubrugt netværk er ikke længere cofaktor-begrænset, og produktionen kan øges.

Ud over at modificere udbyttet af metaboliske netværk, ændre cofaktorer anvendes i et netværk kan reducere driftsomkostningerne, når de forsøger at danne et ønsket produkt. NADH og NADPH er to yderst almindelige cellulære cofaktorer, som kun adskiller sig ved tilstedeværelsen af ​​en phosphatgruppe. Men denne phosphatgruppe gør NADPH meget mindre stabil end NADH og derfor dyrere at syntetisere. Således er det fordelagtigt at forsøge at benytte NADH er nogle mobilnetværk fordi det ofte er billigere, mere let tilgængelig, og udretter den samme opgave som NADPH.

Værktøjer og processer

Cofaktor engineering oftest beskæftiger sig med manipulation af mikroorganismer, såsom Saccharomyces cerevisiae og Escherichia coli, og som sådan kræver anvendelse af rekombinant DNA-teknikker. Disse teknikker udnytter små cirkulære segmenter af DNA kaldet plasmider, der kan indføres og indarbejdet af mikroorganismer, såsom Escherichia coli. Disse plasmider er specielt designet i laboratorier til let indarbejdes, og påvirke ekspressionen af ​​forskellige proteiner, metabolitter og enzymer. For eksempel kan et bestemt plasmid medføre en ændring i et enzyms aminosyresekvens, som kan øge dens affinitet for et bestemt substrat.

Mikroorganismer kræver et medium til at vokse i, og en almindeligt anvendt til kulturer af Escherichia coli er Luria-Bertani-bouillon. Dette medie er ofte suppleret med glucose og vil ofte indeholde yderligere molekyler skal lette optimal vækst kultur. Pre-kulturer kan derefter dyrkes i rystekolber. Disse er blot tilsluttet Erlenmeyerkolber, der er tilbage på en orbitalryster maskine, der roterer med meget høj RPM. Denne proces ilter kultur, som er nødvendig for optimal vækst. Når præ-kulturer er klar, er plasmiderne brug af særlige forsøg sat til hver kultur for sig, og derefter hver kultur overføres til en bio-reaktor. Bioreaktorer er systemer, som tillader kulturer til at vokse i et kontrolleret miljø. Dette efterlader de indførte plasmider som den eneste uafhængige variable. Den ønskede temperatur, pH, metabolitkoncentrationer, og forskellige andre miljømæssige faktorer kan opretholdes ved bio-reaktor sikrer identiske betingelser for hver kultur vækst.

Når prøverne lov til at vokse i reaktoren for en bestemt periode, kan de fjernes, og undersøgt for at fastslå, om de tilsigtede ændringer i organismen er indlysende. Da cofaktor engineering oftest beskæftiger sig med metaboliske veje, er disse organismer ofte undersøgt, men om særlige mærkede fluorescerende metabolitter og dokumentere deres progression gennem forskellige veje. I andre tilfælde er resultaterne mere indlysende og let observerbare, såsom med nedsat ethanolproduktion af gær nævnt nedenfor.

Applikationer

Ændring et enzyms Cofactor Fra NADPH til NADH

Der kræves biokatalysatorer til fremstilling af chirale byggeblokke nødvendige lægemidler og andre kemikalier, der anvendes af samfundet. Mange af disse biokatalysatorer kræver NADPH som cofaktor. NADPH, en cofaktor helt svarer til NADH, er både dyrere og mindre stabil end dens modstykke NADH. Af disse årsager vil producenter foretrækker at biokatalysatorer de bruger i deres produktionslinjer accepterer NADH løbet NADPH. Cofaktor engineering har for nylig haft succes med at ændre enzymer at foretrække NADH som en cofaktor i stedet for NADPH. I 2010, en gruppe forskere udførte cofaktor engineering på enzymet Gre2p, en NADPH-foretrak dehydrogenase fundet i Saccharomyces cerevisiae. Gre2p reducerer forbindelsen diketonen 2,5-hexandion i de chirale byggesten hydroxy-2-hexanon og -hexanediol. Forskerne fastslået, at Asn9 var en vigtig aminosyre det aktive sted i Gre2p. Specifikt Asn9 binder til 3'-hydroxylgruppen og 2'-oxygenatomet i adenyl ribosedel. Gennem direkte mutagenese, forskerne udvekslede Asn9 for både Asp og Glu. Denne ændring skyldes Gre2p at have en reduceret afhængighed af NADPH, og en forøget affinitet for NADH. Dette resulterede i øget Gre2p aktivitet ved brug af NADH. Det blev observeret, at erstatte Asn9 med Glu produceret en større effekt end at ændre Asn9 til Asp. Asn indeholder en polær uladet sidekæde, mens både Asp og Glu indeholder en polær ladet sidekæde. Den øgede effekt af Glu skyldes den ekstra carbon i sin sidekæde, der bringer den tættere på adenyl ribosedelen. Dette giver mulighed for en stærkere hydrogenbinding mellem 2'- og 3'-ribose hydroxylgrupper og sidekædecarboxylgruppen. Den maksimale hastighed af reaktionen fordoblet, mens du bruger NADH, da Asn9 blev substitueret med Glu. Med disse resultater, at forskerne med succes manipuleret Gre2p foretrækker NADH løbet NADPH og øget hastigheden på 2,5-hexandion reduktion. Dette vil gøre det muligt for kemiske virksomheder at mindske deres produktionsomkostninger ved at bruge NADH stedet for NADPH i det mindste for denne særlige reduktion.

Ændring af en netværkets Cofactor præference

Et alternativt eksempel på at ændre et enzyms præference for cofaktorer er at ændre NADH afhængige reaktion på NADPH-afhængige reaktioner. I dette eksempel enzymerne selv er ikke ændret, men i stedet forskellige enzymer, der er valgt udføre den samme reaktion under anvendelse af en anden cofaktor. Et manipuleret pathway blev skabt for at gøre 1-butanol fra acetyl-CoA ved at ændre enzymer i den metaboliske vej for S. elongatus. Clostridium slægten er kendt at fremstille 1-butanol, hvilket giver en vej, der kunne indsættes i S. elongatus. Denne vej syntetiserer 1-butanol under anvendelse af den omvendte β-oxidation pathway. De involverede i denne nyligt manipuleret vej enzymer var NADH specifikke, som var problematisk for replikering vejen i S. elongatus som cyanobakterier producere meget mere NADPH end NADH.

Forskergruppen derefter identificeret enzymer, der udnytter NADPH eller begge NADPH og NADH ved bioprospektering. Acetoacetyl-CoA reduktase blev fundet at være en egnet erstatning for hydroxysmørsyre dehydrogenase. For at udskifte AdhE2, fandt forskerne, at NADP-afhængige alkoholdehydrogenase fra E. coli at være effektive for vejen. Desuden har forskerne en dehydrogenase at erstatte aldehyddehydrogenase kapacitet AdhE2. CoA-acylerings- butyraldehyd dehydrogenase fra C. saccharoperbutylacetonicum viste sig at være en god kulør. Sammen PhaB, Bldh, yqhD kan erstatte HBD og AdhE2 henholdsvis at ændre præference for 3-ketobutyryl-CoA reduktion cofaktor fra at bruge NADH til NADPH hjælp. Forfatterne konstrueres derefter forskellige kombinationer af de forskellige enzymer ved overekspression forskellige gener i kulturer af S. elongatus PCC 7942. For at gøre det, de er konstrueret plasmider indeholdende generne svarende til enzymerne og kombineret i genomet af S. forlænges. Efter enzymassays, stammen af ​​cyanobakterier udtrykker NADPH udnytte enzymer produceret den største mængde af 1-butanol, der overstiger den af ​​stammer, der ikke består af NADPH udnytte enzymer med fire gange. Samlet blev 1-butanol produceret i S. elongatus anvendelse af en vej fra en anden organisme. Denne vej blev ændret for at matche den foretrukne reducerende cofaktor for cyanobakterier.

Ændring Metabolit Flux med Cofactor Equilibrium

I cofaktor teknik, er en metabolisk vej ændres ved at ændre koncentrationen af ​​bestemte cofaktorer, der produceres enten i en bestemt reaktionsvej eller i en separat pathway. For eksempel kan en hypotetisk organisme kunne have to vilkårlige veje kaldes A og B, hvor nogle enzymer i både A og B anvender de samme cofaktorer. Hvis forskerne ønskede at nedsætte produktionen af ​​pathway A, kan de først overveje direkte engineering de enzymer, der er involveret i A, måske for at mindske et bestemt aktivt websted affinitet for dets substrat. I nogle tilfælde kan imidlertid enzymer i A være vanskeligt at konstruere forskellige årsager, eller det kan være umuligt at konstruere dem uden farlig påvirke nogle tredje metaboliske pathway C, som udnytter de samme enzymer. Som en separat indstilling, kan forskerne øge fluxen af ​​B, hvilket kan være lettere at konstruere. Dette vil til gengæld kunne "binde op" de cofaktorer kræves af A, hvilket vil bremse enzymatisk aktivitet, faldende produktion i A. Dette er et tænkt eksempel på, hvordan cofaktor teknik kan bruges, men der er mange andre unikke tilfælde, hvor forskerne bruger cofaktorer som en måde at ændre metaboliske veje. En stor fordel for cofaktor engineering er, at forskerne kan bruge det med held ændre metaboliske veje, der er vanskelige at ingeniør ved hjælp af almindelig metabolisk engineering. Dette opnås ved at målrette lettere manipulerede enzymer i separate veje, som anvender samme cofaktorer. Da mange cofaktorer anvendes af forskellige enzymer i flere veje kan cofaktor engineering være en effektiv, omkostningseffektiv alternativ til de nuværende metoder til metabolisk engineering.

Gær er almindeligt anvendt i øl og vin industrien, fordi de er i stand til effektivt at producere ethanol ved den metaboliske pathway fermentering i fravær af oxygen. Fermentering kræver enzymet glycerol-3-phosphatdehydrogenase, som afhænger af cofaktor NADH. Denne vej involverer omdannelsen af ​​glucose til både ethanol og glycerol, som begge bruger NADH som en cofaktor. Forskere manipuleret Saccharomyces cerevisiae at overproducere GPDH, der skiftede celler metaboliske flux væk fra ethanol og mod glycerol, ved at begrænse NADH tilgængelighed i ethanolproduktion del af vejen. Den modsatte effekt blev opnået ved at påvirke en separat pathway i cellen, glutamat syntesevejen. Inaktivere ekspression af enzymet glutamatdehydrogenase, som er NADPH afhængig, og overudtrykker enzymerne glutaminsynthetaseinhibitorer og glutamat syntetase, der er afhængige af NADH som en cofaktor flyttet cofaktor balance i glutamat syntesevejen. Den vej er nu afhængig af NADH snarere end NADPH, hvilket nedsætter NADH tilgængelighed i gæring vej. Dette vil til gengæld forårsager forøget ethanolproduktion og nedsat glycerol produktion. Denne metode til at manipulere metaboliske flusmidler kunne visualiseres meget gerne globale brændstof markeder, hvor den øgede produktion af ethanol til brug i bilindustrien vil mindske dens tilgængelighed i fødevareindustrien. Væsentlige, kunne producerer flere motorer, der kører på ethanol resultere i nedsat forbrug af forarbejdede slik, som indeholder majssirup med højt fructoseindhold. Denne konstruktion af cofaktorer finder anvendelse på øl og vin industrien, da det giver mulighed for regulering af ethanol niveauer i alkoholholdige drikkevarer. Fremskridt i vinindustrien har forårsaget en støt stigning i ethanolindhold, så vinmagere i særdeleshed ville være interesseret i muligheden for at reducere ethanol niveauer af nogle af deres vine.

Citronsyrecyklus

Coenzym A og acetyl-CoA er to mellemliggende metabolitter, især findes i citronsyrecyklen, der deltager i over 100 forskellige reaktioner i metabolismen af ​​mikroorganismer. Nylige eksperimenter har vist, at overekspression af enzymet pantothenat kinase og tilskud af pantothensyre i CoA biosyntesevejen har tilladt justeringer af både CoA og acetyl-CoA flusmidler. Denne øgede koncentration af cofaktorer resulterede i en øget carbon flux i isoamylacetat syntesevejen, øge produktionseffektiviteten af ​​isoamylacetat. Isoamylacetat bruges industrielt til kunstig aroma og til at teste effektiviteten af ​​åndedrætsværn. Ud over produktion af isoamylacetat, manipulation af CoA biosyntese under pyruvat hydrogenase reaktion forårsager også en stigning i produktion af både succinat og lycopen, der hver især have gavnlige virkninger på den menneskelige krop. En stigning i koncentrationen succinat, der anvendes som en katalysator, kan føre til en stigning i hastigheden af ​​citronsyrecyklus, og dermed en persons stofskifte. Stigende lycopen koncentrationer, har vist sig at nedsætte risikoen for prostatacancer. De potentielle fordele ved at gentage en sådan bedrift cofaktor teknik og held indarbejde dem i praksis i branchen er utallige.

Papirfremstilling

Mange vigtige industrielle enzymer bruge cofaktorer til katalyse reaktioner. Ved at bruge cofaktorer til at manipulere metaboliske veje, er det muligt at reducere materialeomkostninger, fjerne etaper af produktionen, reducere produktionstiden, mindske forureningen og øge den generelle produktionseffektivitet. En sag, der viser flere af disse fremstiller fordele involverer gensplejsning af asp træer. I produktionsprocessen papiret, skal produktionsanlæg nedbryde lignin, en biokemisk forbindelse, som giver en træstamme sin stivhed, med henblik på at danne pulp, der anvendes i resten af ​​produktionen. Den kemiske pulpning proces kræver fremstillingsanlæg at bruge en betydelig mængde energi, samt mange dyre og giftige kemikalier. En gruppe af genetiske ingeniører, gennem cofaktor teknik, manipuleret genetisk overlegen asp træ, der produceres mindre lignin. Disse gensplejsede træer er tilladt for papirfabrikker til at reducere deres omkostninger, forurening, og produktion tid.

Andre eksempler

En kort beskrivelse af andre væsentlige eksempler, hvor der er anvendt cofaktor engineering.

  0   0
Forrige artikel Evano Oruvan
Næste artikel Elveskud

Kommentarer - 0

Ingen kommentar

Tilføj en kommentar

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Tegn tilbage: 3000
captcha