CDNA-bibliotek

Et cDNA-bibliotek er en kombination af klonede cDNA-fragmenter indsat i en samling af værtsceller, som tilsammen udgør en del af transkriptomet af organismen. cDNA fremstilles fra fuldt transkriberede mRNA fundet i kernen og indeholder derfor kun de udtrykte gener i en organisme. Ligeledes kan vævsspecifikke cDNA-biblioteker frembringes. I eukaryote celler det modne mRNA allerede splejset, dermed cDNA'et produceret mangler introns og kan let udtrykkes i en bakteriecelle. Mens oplysninger i cDNA-biblioteker er et kraftfuldt og nyttigt værktøj, da genprodukter let identificeres, bibliotekerne mangler information om enhancere, introner og andre regulatoriske elementer, der findes i et genomisk DNA-bibliotek.

cDNA-bibliotek Construction

cDNA er skabt ud fra et modent mRNA fra en eukaryot celle ved anvendelse af et enzym kaldet revers transkriptase. I eukaryoter, en poly- hale adskiller mRNA fra tRNA og rRNA og kan derfor anvendes som en primer site for revers transkription. Dette har det problem, at ikke alle transkripter, såsom dem for histon, koder for en poly-A-hale.

mRNA udvinding

For det første mRNA opnået og oprenset fra resten af ​​RNA'erne. Der findes flere metoder til rensning af RNA, såsom Trizol ekstraktion og kolonne rensning. Søjleoprensning gøres ved hjælp af oligomere dT nukleotidsekvenser overtrukket harpikser hvor kun mRNA der poly-A-halen vil binde. Resten af ​​RNA'er elueres ud. MRNA elueres ved anvendelse af elueringspufferen og nogle varme at adskille strengene mRNA fra oligo-dT.

cDNA byggeri

Når mRNA oprenses, er oligo-dT mærket som en supplerende primer, som binder til poly-A-halen giver en fri 3'-OH ende, kan forlænges med revers transkriptase for at skabe den komplementære DNA-streng. Nu er mRNA fjernes ved hjælp af en RNAse enzym efterlader et enkeltstrenget cDNA. Denne sscDNA omdannes til et dobbeltstrenget DNA ved hjælp af DNA-polymerase. Men for DNA-polymerase til at syntetisere en komplementær streng en fri 3'-OH enden er nødvendig. Dette tilvejebringes ved sscDNA selv ved at generere en hårnål loop i 3'-enden ved at vikle sig selv. Polymerasen forlænger 3'-OH ende og senere løkken 3'-enden åbnes af klipning virkning af S1 nuclease. Restriktionsendonukleaser og DNA-ligase anvendes derefter til at klone sekvenser i bakterielle plasmider.

De klonede bakterier udvælges derefter, sædvanligvis ved anvendelse af antibiotisk selektion. Når det er valgt, lagre af bakterierne skabt som senere kan dyrkes og sekventeret at kompilere cDNA bibliotek.

cDNA bibliotek bruger

cDNA-biblioteker er almindeligt anvendt ved reproduktion eukaryote genomer, som mængden af ​​information er reduceret for at fjerne det store antal af ikke-kodende regioner fra biblioteket. cDNA-biblioteker anvendes til at udtrykke eukaryote gener i prokaryoter. Prokaryoter ikke har introns i deres DNA og derfor ikke har nogen enzymer, der kan skære det ud i transskription proces. cDNA ikke har introns og derfor kan udtrykkes i prokaryote celler. cDNA biblioteker er mest nyttige i revers genetik, hvor yderligere genomisk oplysninger er mindre brug. Det er også nyttigt for efterfølgende at isolere det gen, der koder for mRNA'et.

cDNA-bibliotek Genomisk DNA vs. Library

cDNA-bibliotek mangler den ikke-kodende og regulatoriske elementer fundet i genomisk DNA. Genomisk DNA biblioteker give mere detaljerede oplysninger om organismen, men er mere ressourcekrævende at generere og vedligeholde.

Hvordan kan vi klone cDNA molekyler?

cDNA-molekyler kan klones ved hjælp restriktionssted linkere. Linkere er korte, dobbeltstrengede DNA-stykker, ca. 8 til 12 nukleotidpar lange, der indeholder en restriktionsendonukleasespaltningssted f.eks BamHI. Både cDNA og linkeren har stumpe ender, som kan ligeres sammen under anvendelse af en høj koncentration af T4 DNA-ligase. Så klæbrige ender produceres i cDNA-molekylet ved spaltning af cDNA-ender med en passende endonuklease. En kloningsvektor er så også spaltes med passende endonuklease. Efter "sticky ende" ligering af indsatsen i vektoren det resulterende rekombinante DNA-molekyle overføres til E. coli værtscelle til kloning.

  0   0
Forrige artikel Bridgwater Canalside Centre
Næste artikel Sne skur

Kommentarer - 0

Ingen kommentar

Tilføj en kommentar

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Tegn tilbage: 3000
captcha